IPHASE/匯智和源 轉運體研究試驗原理、試驗設計及常見問題解答

第一題 如何評估吸附能力強的化合物分子是吸附在細胞表面或是轉運進入內部？清洗次數如何確定？

答：實驗組細胞通過和MOCK細胞進行對比，吸附能力強的化合物分子會在轉運體細胞和MOCK細胞上同時吸附，而轉運體細胞可將化合物轉運進細胞，MOCK細胞不能進行轉運，通過檢測結果即可判斷。清洗次數可以對每次清洗的上清液進行檢測，當清洗相應次數后上清液檢測不到待測化合物時，即可確定清洗次數。

第二題 PROTAC，小核酸吸附強是否可以用膜囊泡？

答：對于PROTAC分子或小核酸這類吸附性強的化合物，使用膜囊泡模型是合適的，因為膜囊泡可以使ABC轉運體的底物結合位點暴露于細胞外緩沖液中，更適用于研究候選藥物作為底物和抑制劑與ABC轉運體的相互作用。

第三題 瞬轉SLC細胞在液氮凍存，時間久了是否會影響蛋白活性？

答：SLC轉運體瞬時轉染會隨著時間延長，蛋白活性會逐步降低。

第四題 SLC轉運體細胞在藥物作用前去掉培養液后，是否需要用反應緩沖液預孵育幾分鐘？

答：通常情況下，去掉培養液后，細胞可能會需要一段時間來適應新的環境，使用反應緩沖液預孵育可以幫助細胞穩定，減少由于環境變化引起的影響。

第五題 實驗過程中最后一步裂解囊泡除了乙腈是否可以使用其他的有機試劑？如果離心離不下來是否和裂解試劑不合適有關？

答：強堿類（NaOH），甲醇等均可以，離心推薦轉速8000rpm-16000rpm，離心力過低不易離心下去。

第六題 不同表達宿主，Sf9和HEK293，表達出來的Vesicle細胞是否會有差異？

答：Sf9和HEK293作為不同的宿主在蛋白質修飾、折疊和分泌機制不同，相較于SF9而言，HEK293（人胚胎腎）細胞表達的Vesicle細胞其蛋白質修飾和分泌機制更接近人體自然狀態下的生物過程。

第七題 早期化合物多篩選階段主要推薦做哪幾個轉運體實驗？

答：主要推薦的轉運體實驗包括底物抑制實驗和轉運活性實驗，包括指南推薦的7種SLC轉運體。

第八題 做囊泡實驗使用的反應管是每個單獨的嗎？

答：是的，實驗設計會使用單獨的反應管來進行囊泡實驗，這樣可以為每個樣本提供更靈活的操作和處理條件。

第九題 選擇微孔板過濾器時，PVDF材質和Glass Fiber這兩種材質有何區別？

答：PVDF材質和Glass Fiber各有特點，PVDF具有良好的化學穩定性和耐熱性，而Glass Fiber則提供了較高的孔隙率和流速。針對囊泡裂解使用的是乙腈，PVDF材質效果更好。

第十題 若低中濃度做出來不是轉運體的底物，高濃度做出來是，具體是什么原因？

答：首先需要確定低中濃度的范圍是否儀器可以檢測到，例如選取的底物濃度在儀器的檢測基線以下，則無法反應準確的轉運活性。

十一題 對于OATP1B1和1B3，采用共孵育也可以達到要求，是否還需要預孵育？

答：參照指導原則推薦，OATP1B1和1B3存在時間依賴性抑制，需要進行預孵育。

十二題 囊泡的結果如何評判？

答：根據指導原則的要求，待測底物轉運活性大于2倍，且通過已知抑制劑抑制率大于50%，即可判定為ABC轉運體的底物。待測抑制劑，需通過已知底物檢測，抑制率大于50%即可判定為ABC轉運體的抑制劑。

十三題 反應條件是水浴鍋還是搖床？

答：37℃水浴鍋或者搖床都可以，但搖床需要靜止。

十四題 囊泡、細胞、PAMPA三種實驗是否有必要都做？若只做一種，優先級是否為表達轉運體的細胞實驗？

答：囊泡、細胞和PAMPA三種實驗各有優勢和局限性。囊泡實驗可以提供關于轉運體功能的直接信息，細胞實驗可以模擬體內環境，而PAMPA則是一種快速篩選工具。如果只做一種實驗，過表達轉運體的翻模囊泡更接近人體自然狀態下的生物過程，同時便于檢測，因此優先級較高。

十五題 SLC轉運體細胞藥物作用終止后，用乙腈、甲醇等有機溶劑或反復凍融方法是否都可以裂解細胞？

答：是的，乙腈、甲醇等有機溶劑以及反復凍融方法都可以用來裂解細胞。

十六題 高通透性化合物為什么不需要預孵育？透膜的能力是否和轉運蛋白結合能力一致？

答：高通透性化合物不需要預孵育是因為它們可以迅速通過細胞膜，不需要額外的時間來與轉運蛋白結合。透膜能力和轉運蛋白結合能力并不總是一致的，因為它們受多種因素的影響，包括分子大小、電荷、脂溶性等。

十七題 囊泡是否能搖？

答：底物與囊泡孵育過程需要靜置，都處于游離狀態時，底物與囊泡不易結合進行轉運。

十八題 不能用水浴鍋是否因為配套的管子不是封閉的？

答：配套的微孔過濾器適用于囊泡的后半部分進行清洗過程，前期孵育需自備普通1.5ml離心管，或者PCR小管。

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