CYP450酶代謝表型研究(化學抑制法)原理及實驗方法

1    概述

1.1 藥物代謝研究簡介

藥物代謝研究是創新藥物研發的重要內容，它不僅決定了創新藥物制劑研發的成敗，而且與創新藥物研發的速度和質量有密切關系。因而，藥物代謝研究在新藥研發工程中具有*的重要作用，研究藥物代謝對于了解藥物在體內的變化過程至關重要。

藥物代謝研究的方法主要分為體內和體外兩種。體內代謝法因藥物在生物體內的分布較廣，加上代謝轉化的器官和酶系的多樣性，使藥物及其代謝產物在體內的濃度比較低，代謝產物的檢測具有一定的困難。體外代謝法在短時間內可以得到大量的代謝產物，且代謝條件可控，代謝體系比較“干凈"，代謝物易于分離、提取，有利于代謝途徑研究及代謝產物結果的確定等，因而，體外代謝法具有突出的*性。

由于肝臟是藥物代謝的主要場所，體外代謝模型多以肝臟為基礎。目前，研究體外代謝方法主要有：肝微粒體體外溫孵法、重組P450酶體外溫孵法、肝細胞體外溫孵法、肝臟離體灌流法和肝切片法。其中，肝微粒體體外溫孵法與其他體外代謝方法相比，酶制備簡單，代謝過程快，重現性好，易大量操作，同時可用于藥物代謝酶的抑制及體外清除等方面的研究，因而在實際工作中應用較為普遍。

1.2 CYP450酶代謝表型研究的重要性

藥物代謝酶表型鑒定，主要是研究參與藥物清除的代謝酶的類型、數量和相對貢獻率。如果藥物主要通過單一的代謝途徑對藥物進行清除，可能會存在很大的用藥風險；相反，如果某一藥物的代謝過程涉及的代謝酶越多，則說明其代謝途徑也越多，也就難以發生潛在的藥物-藥物相互作用，使得患者之間的治療偏差降低。因此，在新藥臨床前研究中，對藥物的代謝酶表型進行鑒定，獲得其主要代謝酶的消除比例，闡明參與藥物體內代謝轉化的相關酶亞型，對于研究藥物的代謝機制，預測藥物代謝多態性和藥物間相互作用等方面具有重要意義。

1.3 CYP450酶及代謝表型研究方法

CYP450為一類含亞鐵血紅素蛋白的超家族，根據相關酶亞型在藥物代謝中的重要程度，可將CYP450分為以下三類：（1）主要CYP450，包括CYP1A2、CYP2C9 、CYP2C19 、CYP2D6 和CYP3A4；（2）較主要CYP450，包括CYP2B6、CYP2C8和CYP3A5；（3）次要CYP450，包括CYP1A1、CYP1B1、CYP2A6、CYP2E1、CYP2J2和CYP4A11等。參與藥物代謝的動物肝微粒體P450酶較為復雜，而人肝微粒體中參與藥物代謝的P450酶相對比較簡單，主要有CYP1A、CYP2C、CYP2D、CYP2E和CYP3A，其組成見圖1。

圖1 人肝內P450酶的組成

目前，CYP450的酶表型鑒定主要使用以下3種方法：選擇性抑制法、重組人源CYP450同工酶法、相關性分析法。選擇性抑制法又分為化學抑制法和抗體抑制法，即在加入和不加入一系類CYP450酶亞型選擇性化學抑制劑或抗體的條件下，分別測定人肝微粒體對藥物的代謝活性，以考察人肝微粒體中CYP450酶亞型倍選擇性抑制后，藥物的代謝是否受到影響，從而計算相對抑制百分率，推斷CYP450酶代謝表型。其中，化學抑制法由于其操作簡單，且價格低廉而得到廣泛應用。

2    實驗原理

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參與藥物代謝的CYP450酶主要為CYP1、CYP2和CYP3三個家族，其中CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4/5是主要的藥物代謝酶。CYP2B6和CYP2C19在體外沒有特異性的選擇性抑制可用，一般還需結合重組酶法進行其表型確定。噻氯匹定是CYP2B6的抑制劑，諾卡酮是CYP2C19的抑制劑，α-奈黃酮為CYP1A2的特異的選擇性抑制劑，槲皮素為CYP2C8的特異的選擇性抑制劑，磺胺苯吡唑為CYP2C9的特異的選擇性抑制劑，奎尼丁為CYP2D6的特異的選擇性抑制劑，酮康唑為CYP3A4/5的特異的選擇性抑制劑，如選用特異的選擇性抑制劑抑制不同亞型的酶的活性，便可通過化學抑制法研究藥物的CYP450酶代謝表型。

3    實驗方法描述

肝微粒體體外溫孵法是采用肝微粒體，輔以NADPH再生系統（IPHASE匯智和源），在體外模擬生理環境條件進行代謝反應，經過一定時間的反應后，采用HPLC、LC-MC和LC-MC/MC等測定溫孵液中原型藥物或其代謝產物的濃度，分析其主要代謝途徑。

3.1 肝微粒體制備

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P450酶主要在肝臟中表達，肝臟中的P450酶在體外是以微粒體的形式存在的。微粒體是指在細胞勻漿和差速離心過程中獲得的由破碎的內質網自我融合形成的近似球形的膜囊泡狀結構，是異質性的集合體。它包含內質網膜和核糖體兩種基本成分，在體外實驗中具有蛋白質合成、蛋白質糖基化和脂類合成等內質網的基本功能。目前，制備肝微粒體常用的方法是差速離心法。具體制備流程見下圖（圖2）：

圖2 肝微粒體制備流程圖

3.2 體外孵育體系的建立

CYP450酶代謝表型研究的肝微粒體體外孵育體系，是由制備的肝微粒體輔以氧化還原型輔酶，再加入酶特異的選擇性抑制劑，在模擬生理溫度及生理環境的條件下進行生化反應的體系。

推薦使用的孵育體系為：每個孵育體系總體積為200 µL，體系包括0.1M PH 7.4 的磷酸緩沖液，匯智和源NADPH再生系統（1mM NADP，5 mM的6-磷酸葡萄糖，1 U/mL 6-磷酸葡萄糖脫氫酶，3.3 mM的氯化鎂）；適當濃度的肝微粒體蛋白；適量的選擇性抑制劑；合適濃度的待測物，于37°C水浴孵育，每個樣品平行3次，以不加選擇性抑制劑組為對照。于預設的反應時間點，加入等體積預冷的乙腈終止反應。

3.3 原型藥物或代謝產物的檢測

采用HPLC、LC-MC和LC-MC/MC等測定溫孵液中原型藥物或其代謝產物的濃度。

例：

下圖（圖3、圖4、圖5）為研究某一候選藥物的CYP450酶代謝表型的實驗，該實驗采用選擇性化學抑制劑的方法分析了該藥物在鼠、犬和人肝微粒體中的代謝情況，從而判斷微粒體中哪些CYP450亞型是該藥物的主要代謝酶。

數據計算：

用待測物的消除速率表示待測物在微粒體孵育體系中的代謝速率。

抑制率%=（1- 加入抑制劑樣品代謝速率/空白對照樣品代謝速率）×100%

圖3 大鼠肝微粒中某藥物的代謝抑制率

圖4 犬肝微粒中某藥物的代謝抑制率

圖5 人肝微粒中某藥物的代謝抑制率

從上圖可知，不同種屬微粒體中，該候選藥物的代謝抑制率存在差異。表明，不同種屬微粒體中參與該候選藥物代謝的酶亞型可能不同。

4    CYP450酶代謝表型研究試劑盒簡介

本公司針對CYP450酶代謝表型研究的需要，以肝微粒體體外溫孵法為指導，以化學抑制法為基礎，開發了一款專門用于CYP450酶代謝表型研究的試劑盒，該產品可直接用于藥物CYP450酶代謝表型研究，省去了肝微粒體制備和試劑配制的繁瑣過程，大大縮短了實驗周期，且試劑盒各組成成分經過嚴格的質量檢測，符合CYP450酶代謝表型研究試驗要求，實驗結果準確、可靠、重現性好。

4.1 產品說明

本產品提供了采用化學抑制法進行CYP450酶代謝表型研究的所有試劑，可直接用于藥物CYP450酶代謝表型的研究，省去了試劑配制的繁瑣過程，且試劑盒各組成成分經過嚴格的質量檢測，實驗結果準確、可靠、重現性好。

根據微粒體種屬的不同，可根據實際需求選擇人肝微粒體、恒河猴肝微粒體、比格犬肝微粒體、大鼠肝微粒體和小鼠肝微粒體中的一種。

4.2 試劑盒優勢

便捷——本試劑盒省去了肝微粒體制備和試劑配制時間，可以直接使用，大大縮短了實驗周期。

準確——本試劑盒各成分均經過嚴格的質量檢測，實驗結果準確、可靠、重現性高。

穩定——本試劑盒穩定性強、易于運輸和保存。

4.3 產品組成

50反應/盒，200μL/反應。

4.4 產品使用說明

4.4.1 試驗組

1）冰浴融化試劑盒各組分，置于冰上待用；

2）除微粒體外，將孵育體系其它各組分按照配比混合并吹吸混勻，于37℃預孵育5min；

3）將以上混合液195μL/管分裝至2.0mL離心管中，于37℃水浴中保溫， 5μL/反應加入肝微粒體，吹吸3次混勻于37℃水浴條件下啟動代謝反應，使用秒表計時；

4）于設定孵育時間點，向孵育體系中加入終止液終止反應（如預冷乙腈，預冷乙腈體積：孵育體系體積=1:1）。

例：200μL孵育體系配制：

注：a.體系中有機溶劑加入量不得大于1%；

b.若實際需要n個孵育體系，則需配置n＋1個體系。

4.4.2對照組：

1）陽性底物組：反應體系中不加選擇性抑制劑，并將受試物換為陽性底物，其它組分加入量不變，缺少體積用0.1M PBS緩沖液補齊；

2）無抑制劑組：反應體系中不加選擇性抑制劑，其它組分加入量不變，缺少體積用0.1M PBS緩沖液補齊；

無A、B液組：反應體系中不加A液和B液，其它組分加入量不變，缺少體積用0.1M PBS緩沖液補齊。

4.4.3結果計算：

采用底物消除法評價試驗結果，用待測物的消除速率表示待測物在微粒體孵育體系中的代謝速率；

抑制率%=（1-加入抑制劑樣品代謝速率/無抑制劑組樣品代謝速率）×100%

4.5 使用注意事項

1）試驗開始前，請自行準備2.0mL離心管、不同規格槍頭、37℃水浴鍋等；

2）本產品僅供科研使用，不能用于人體及動物的治療或臨床診斷；

3）使用前，需于冰浴條件下解凍并混合均勻；

4）于-70℃冰箱冷凍保存，切勿反復凍融；

5）在使用過程中，也可根據實際實驗需求調整試劑盒使用方法和各組分的加入量；

6）因CYP2B6和CYP2C19在體外沒有絕對特異的抑制劑可用，故結果分析還需結合其它結果進行，如重組酶法的結果。

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匯智和源，致力于為創新藥研發企業及生命科學研究機構提供高品質的生物試劑，IPHASE為公司核心品牌，品牌宗旨“Innovative Reagents For Innovative Research"。