平衡透析法測(cè)定血漿蛋白結(jié)合率原理

平衡透析法測(cè)定血漿蛋白結(jié)合率原理

藥物血漿蛋白結(jié)合率（Plasma Protein Binding, PPB）即血液中與蛋白結(jié)合的藥物占總藥量的百分?jǐn)?shù)，可以反映藥物與血漿蛋白結(jié)合的程度。藥物血漿蛋白結(jié)合率是藥物在動(dòng)物體內(nèi)重要的藥理學(xué)參數(shù)之一，影響著藥物體內(nèi)游離濃度進(jìn)而影響藥物的分布與排泄。藥物在進(jìn)入血液后與血漿蛋白會(huì)有不同程度結(jié)合，血液中游離藥物的比例會(huì)影響其在體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄的過(guò)程，與血漿蛋白結(jié)合的藥物可能會(huì)有更長(zhǎng)的半衰期和清除速率，因此測(cè)定血漿蛋白結(jié)合率對(duì)于理解化合物的活性以及組織分布有很重要的參考意義。

1 結(jié)合蛋白類(lèi)型

血漿蛋白主要作為載體負(fù)責(zé)各類(lèi)外源性和內(nèi)源性分子在循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)。其中參與小分子藥物結(jié)合的主要有白蛋白、α-1-酸性糖蛋白（AAG）、球蛋白和脂蛋白，主要以白蛋白和α-1-酸性糖蛋白（AAG）為主。藥物與蛋白的結(jié)合強(qiáng)弱主要與藥物-蛋白親和力、蛋白豐度相關(guān)。

2 血漿蛋白結(jié)合率常用測(cè)定方法

目前常用于藥物血漿蛋白結(jié)合率測(cè)定的常用方法包括平衡透析法（Equilibrium Dialysis），超濾法（Utrafiltration Method），超速離心法（Ultracentrifugation Method），凝膠過(guò)濾法（Gel filtration）等。 其中，平衡透析法是基于藥物結(jié)合的平衡原理來(lái)測(cè)定藥物游離濃度的方法，也是研究藥物血漿蛋白結(jié)合率的經(jīng)典方法。超濾法使用濾膜分立自由的藥物和結(jié)合蛋白的藥物，時(shí)間短，但確定點(diǎn)是藥物容易結(jié)合到超濾過(guò)程使用的器械上，從而影響檢測(cè)結(jié)果。平衡透析法雖然比超濾法耗時(shí)多一些，但它使用teflon鍍層的平衡裝置，能大大減少藥物的非特異性結(jié)合，得到更精確的結(jié)果。目前，平衡透析法已有96孔板的高通量測(cè)試形式，可以實(shí)現(xiàn)同時(shí)測(cè)試大量候選藥物的蛋白結(jié)合率。

平衡透析法

常用血漿：大鼠血漿，小鼠血漿，比格犬血漿，猴血漿，人血漿

分析方法：LC-MS/MS，GC-MS等

各種藥物以一定的比率與血漿蛋白結(jié)合之后，在血漿中會(huì)同時(shí)存在結(jié)合型與游離型兩種類(lèi)型，游離性藥物具有藥物活性。藥物與血漿蛋白結(jié)合會(huì)成為結(jié)合型藥物，暫時(shí)失去藥理活性，并且儲(chǔ)存于血液中，起到藥庫(kù)的作用，對(duì)于藥物作用及其維持時(shí)間長(zhǎng)短具有重要的意義。一般蛋白結(jié)合率高的藥物體內(nèi)消除慢，作用維持時(shí)間長(zhǎng)，藥效平穩(wěn)。結(jié)合率低的藥物體內(nèi)消除快，同時(shí)作用時(shí)間短，藥效有很大的波動(dòng)。

平衡透析法測(cè)定血漿蛋白結(jié)合率是用透析膜將蛋白質(zhì)溶液與緩沖液分隔開(kāi)，建立在兩者之間的一種平衡狀態(tài)，只有分子量小的藥物小分子可以通過(guò)。透析的動(dòng)力是擴(kuò)散壓，擴(kuò)散壓是由橫跨膜兩邊的濃度梯度形成的。透析的速度與膜的厚度、透析的小分子溶質(zhì)在膜兩邊的濃度梯度及透析溫度等因素有關(guān)。平衡透析法能夠直接測(cè)出為與蛋白結(jié)合的藥物小分子的數(shù)量，這是分析蛋白與小分子物質(zhì)結(jié)合的關(guān)鍵，從而能夠求出結(jié)合位點(diǎn)數(shù)及結(jié)合常數(shù)。

圖1：分隔示意圖

如圖所示，利用匯智和源平衡透析膜將左右兩室進(jìn)行分隔，膜左側(cè)加入含藥的待測(cè)藥物，膜右側(cè)加入空白緩沖液，未被結(jié)合的游離藥物可以自由穿過(guò)透析膜，孵育一定時(shí)間后兩側(cè)達(dá)到平衡，游離藥物濃度相等，通過(guò)HPLC或LC-MS/MS等方法測(cè)定兩側(cè)藥物濃度，利用公式即可計(jì)算得到血漿蛋白結(jié)合率。這種透析膜只允許特定分子量的小分子通過(guò)，而阻止蛋白大分子通過(guò)。

平衡透析法在測(cè)定藥物血漿蛋白結(jié)合率具有操作簡(jiǎn)單、溫度易于控制、PH值可調(diào)、設(shè)備成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。但是同時(shí)存在達(dá)成平衡時(shí)間較長(zhǎng)、溶液體積會(huì)變化，且透析時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能會(huì)造成由加熱或代謝引起的被測(cè)物質(zhì)的降解等缺點(diǎn)。因此在利用平衡透析法測(cè)定藥物血漿蛋白結(jié)合率，或者藥物與蛋白質(zhì)相互作用時(shí)需要與其他的一些方法聯(lián)用，才能獲得更準(zhǔn)確的作用信息。一般只有血漿蛋白結(jié)合率高，分布容積小，消除慢以及治療指數(shù)低的藥物在臨床上的這種相互作用才有意義。

匯智和源/匯智泰康ADME服務(wù)項(xiàng)目
血漿蛋白結(jié)合率測(cè)定

代謝穩(wěn)定性研究
肝微粒體代謝實(shí)驗(yàn)
肝細(xì)胞代謝穩(wěn)定性試驗(yàn)
代謝表型研究
代謝產(chǎn)物鑒定
代謝途徑鑒定
種屬比較研究
CYPP450酶抑制實(shí)驗(yàn)（常用CYP450酶包括CYP1A2，CYP2A6，CYP2B6，CYP2C8，CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6，CYP2E1，CYP3A4等）
CYP450酶誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)
血漿穩(wěn)定性試驗(yàn)
跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)
藥物-藥物相互作用
毒理學(xué)研究

4 血漿蛋白結(jié)合試驗(yàn)檢測(cè)試劑盒

匯智和源/匯智泰康針對(duì)血漿蛋白結(jié)合率測(cè)定試驗(yàn)研發(fā)針對(duì)性的平衡透析裝置，平衡透析裝置包括96個(gè)透析池和透析池之間的透析膜組成，可以同時(shí)對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行透析測(cè)定，確定游離化合物比例。透析膜（半透膜）選用高分子膜，孔徑可根據(jù)客戶需求定制。

產(chǎn)品：

血漿蛋白結(jié)合平衡透析裝置
血漿蛋白結(jié)合試劑盒
血漿蛋白結(jié)合試劑盒-猴血漿
血漿蛋白結(jié)合試劑盒-比格犬血漿
血漿蛋白結(jié)合試劑盒-大鼠血漿
血漿蛋白結(jié)合試劑盒-小鼠血漿

試劑盒組分：

①透析膜

②不同動(dòng)物血漿

③PBS緩沖液

注意事項(xiàng)：

①影響血漿蛋白結(jié)合率測(cè)定的因素很多，如溶解度、溫度、非特異性結(jié)合、酯酶代謝等，需要根據(jù)化合物特征，結(jié)合研究目的選擇合適的測(cè)定方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

②如果有的藥物具有很高的蛋白結(jié)合能力，試驗(yàn)條件的微小偏差可能會(huì)使試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)較大偏差，從而大大提高血液中藥物的濃度而引起毒性。

圖2：平衡透析裝置

圖3：半透膜