平衡透析法測定血漿蛋白結(jié)合率原理及裝置

藥物血漿蛋白結(jié)合率（plasma protein binding, PPB）是藥物在動物體內(nèi)重要的藥理學參數(shù)之一，影響著藥物體內(nèi)游離濃度進而影響藥物的處置過程。藥物在進入血液后與血漿蛋白會有不同程度結(jié)合，血液中游離藥物的比例會影響其在體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄的過程，與血漿蛋白結(jié)合的藥物可能會有更長的半衰期和清除速率，因此測定血漿蛋白結(jié)合率對于理解化合物的活性以及組織分布有很重要的參考意義。
1 結(jié)合蛋白類型
血漿蛋白主要作為載體負責各類外源性和內(nèi)源性分子在循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)的轉(zhuǎn)運。其中參與小分子藥物結(jié)合的主要有白蛋白、α-1-酸性糖蛋白（AAG）、球蛋白和脂蛋白，主要以白蛋白和AAG為主。藥物與蛋白的結(jié)合強弱主要與藥物-蛋白親和力、蛋白豐度相關。


2 血漿蛋白結(jié)合率常用測定方法
目前常用于PPB測定的方法主要包括平衡透析法（equilibrium dialysis），超濾法（utrafiltration method），超速離心法（ultracentrifugation method），凝膠過濾法（gel filtration）等。 其中，平衡透析法是基于藥物結(jié)合的平衡原理來測定藥物游離濃度的方法，也是研究藥物血漿蛋白結(jié)合率的經(jīng)典方法。

平衡透析法
常用種屬：大鼠，小鼠，犬，猴，人
分析方法：LC-MS/MS

各種藥物以一定的比率與血漿蛋白結(jié)合之后，在血漿中會同時存在結(jié)合型與游離型兩種類型，游離性藥物具有藥物活性。藥物與血漿蛋白結(jié)合會成為結(jié)合型藥物，暫時失去藥理活性，并且儲存于血液中，起到藥庫的作用，對于藥物作用及其維持時間長短具有重要的意義。一般蛋白結(jié)合率高的藥物體內(nèi)消除慢，作用維持時間長，藥效平穩(wěn)。結(jié)合率低的藥物體內(nèi)消除快，同時作用時間短，藥效有很大的波動。

平衡透析法測定血漿蛋白結(jié)合率是用透析膜將蛋白質(zhì)溶液與緩沖液分隔開，建立在兩者之間的一種平衡狀態(tài)，只有分子量小的藥物小分子可以通過。透析的動力是擴散壓，擴散壓是由橫跨膜兩邊的濃度梯度形成的。透析的速度與膜的厚度、透析的小分子溶質(zhì)在膜兩邊的濃度梯度及透析溫度等因素有關。平衡透析法能夠直接測出為與蛋白結(jié)合的藥物小分子的數(shù)量，這是分析蛋白與小分子物質(zhì)結(jié)合的關鍵，從而能夠求出結(jié)合位點數(shù)及結(jié)合常數(shù)。

如圖所示，利用半透膜將左右兩室進行分隔，左側(cè)加入含藥的蛋白溶液，右側(cè)加入空白緩沖液，未被結(jié)合的游離藥物可以自由穿過半透膜，孵育一定時間后兩側(cè)達到平衡，游離藥物濃度相等，通過測定兩側(cè)藥物濃度即可計算得到血漿蛋白結(jié)合率。

平衡透析法在測定藥物血漿蛋白結(jié)合率具有操作簡單、溫度易于控制、PH值可調(diào)、設備成本低廉等優(yōu)點。但是同時存在達成平衡時間較長、溶液體積會變化，且透析時間過長可能會造成由加熱或代謝引起的被測物質(zhì)的降解等缺點。因此在利用平衡透析法測定藥物血漿蛋白結(jié)合率，或者藥物與蛋白質(zhì)相互作用時需要與其他的一些方法聯(lián)用，才能獲得更準確的作用信息。一般只有血漿蛋白結(jié)合率高，分布容積小，消除慢以及治療指數(shù)低的藥物在臨床上的這種相互作用才有意義。

3 血漿蛋白結(jié)合平衡透析裝置
    匯智泰康針對血漿蛋白結(jié)合率測定試驗研發(fā)針對性的平衡透析裝置，基于平衡透析法的原理而設計96孔平衡透析裝置，可用于血漿蛋白結(jié)合率的測定。該裝置能夠減少非特異性的透析設備表面的藥物吸附，縮短平衡時間，提高樣品分析的通量。透析膜（半透膜）選用高分子膜，孔徑可根據(jù)客戶需求定制。

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